分離血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用方法
內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell)在全部血管內(nèi)面構(gòu)成單一扁平上皮細(xì)胞層,呈多邊形,細(xì)胞的邊緣呈鋸齒狀,相互嵌合。用酶消化法或機(jī)械刮脫法等可將內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分離,分離的內(nèi)皮細(xì)胞可在培養(yǎng)的條件下生長。
一、原代培養(yǎng)法
(一)灌注消化法
1.材料
(1)標(biāo)本:兔主動脈。
(2)試劑和藥品:PBS、0.05%、培養(yǎng)液、、、0.1%纖維連接蛋白、1.5%明膠。
(3)儀器和材料:手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yǎng)
皿、培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、CO2孵箱、恒溫振蕩器。
2.方法
灌注消化法能夠獲得純度較高的內(nèi)皮細(xì)胞,是分離血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用方法。
(1)取血管:在無菌條件下取出兔主動脈,用PBS沖洗血管腔,洗去血液。
(2)消化內(nèi)皮細(xì)胞:將血管放入培養(yǎng)皿中,從動脈的一段插入靜脈置留針.結(jié)扎固定,然后用絲線將另一端結(jié)扎。通過靜脈置留針向血管內(nèi)注入消化液,至血管充盈為止。在37℃條件下,消化10~15min。
(3)洗滌細(xì)胞:在血管的游離端切口,收集消化液,然后用10ml培養(yǎng)液沖洗管腔。將消化液和沖洗液離心(1000r/min,10min)。吸去上清液,用培養(yǎng)液混懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
(4)包被培養(yǎng)容器:在平皿或培養(yǎng)瓶底部鋪纖維連接蛋白,鋪勻后靜置片刻,吸去剩余液體即可。也可鋪明膠,培養(yǎng)過夜,去除多余明膠。
(5)接種細(xì)胞:調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×105/ml,向25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)接種5ml,或直徑10cm的平皿則接種10ml。
(6)培養(yǎng)細(xì)胞:置37℃、C02孵箱中培養(yǎng),每24h換液1次。以后每隔48h換液1次。約6d后細(xì)胞可融合成單層內(nèi)皮細(xì)胞。
3.結(jié)果觀察30min后內(nèi)皮細(xì)胞開始貼壁,細(xì)胞呈圓形或多邊形。12h后,可見細(xì)胞生長繁殖,呈小簇狀。24h后,細(xì)胞生長形成細(xì)胞群。1周后.每個細(xì)胞群相互融合形成單量.細(xì)胞呈卵石狀排列。
4.注意事項向血管腔內(nèi)注入消化液時,應(yīng)防止消化液溢出,以免消化血管外膜,引起成纖維細(xì)胞的污染。
(二)酶消化法
1.材料
(1)標(biāo)本:兔主動脈。
(2)試劑和藥品:PBS、0.2%膠原酶、培養(yǎng)液、、、O.1%纖維連接蛋白、1.5%明膠。
(3)儀器和材料:手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、c。2孵箱、恒溫振蕩器。
2.方法
(1)取血管:在無菌條件下取出兔主動脈,放入盛有滅菌PBS的平皿中,剝除血管外的脂肪和纖維組織。
(2)暴露內(nèi)皮細(xì)胞:在盛有PBS的培養(yǎng)皿中,縱向剪開血管壁,然后沖洗。
(3)消化內(nèi)皮細(xì)胞:把血管放至盛有5ml膠原酶的平皿中,使血管內(nèi)膜面朝下,置37℃、CO2孵箱中消化10~15min,并多次搖動平皿,以使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。消化近結(jié)束時,可在倒置顯微鏡下觀察。若大部分內(nèi)皮細(xì)胞已脫落,則將消化液移入離心管中。
(4)洗滌細(xì)胞:離心(1000r/min,10min),吸去上清液;再加入5ml PBS懸浮細(xì)胞,再離心,吸去上清液。加入5ml培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。
(5)包被培養(yǎng)容器、接種細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞同灌注消化法。
3.結(jié)果觀察培養(yǎng)30min后,內(nèi)皮細(xì)胞貼壁。1周后,細(xì)胞生長形成單層,呈卵石狀排列。
4.注意事項放入培養(yǎng)皿中的消化液不宜過多,避免消化內(nèi)皮以外的其他各層組織。
(三)機(jī)械刮脫法
1.材料
(1)標(biāo)本:兔主動脈。
(2)試劑和藥品:PBS、培養(yǎng)液、、、O.1%纖維連接蛋白、1.5%明膠。
(3)儀器和材料:手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、C02孵箱、恒溫振蕩器。
2.方法
(1)取血管:按酶消化法摘取長約20cm的大血管,在無菌條件下縱行剪開。
(2)洗滌血管:用PBS洗凈殘血,露出血管內(nèi)皮細(xì)胞。將血管固定在標(biāo)本板上,內(nèi)皮朝上,再用PBS沖洗2次。
(3)刮取內(nèi)皮細(xì)胞:用刮刀輕輕刮取內(nèi)膜表面的內(nèi)皮細(xì)胞。刮取時,刮刀與血管表面成60°,輕柔而均勻地推進(jìn)刮刀。每處只能刮1次,不可刮血管的邊緣。
(4)洗滌細(xì)胞:刮下的內(nèi)皮細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,離心(1000r/min,10min),吸去上清液;再加入15ml培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打,以便分散細(xì)胞團(tuán),再離心1次,并吸去上清液。加入5ml培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。
(5)包被培養(yǎng)容器、接種細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞同灌注消化法。
3.結(jié)果觀察30min后內(nèi)皮細(xì)胞開始貼壁,24h后,細(xì)胞生長形成細(xì)胞群。1周后,細(xì)胞呈卵石狀排列。
4.注意事項刮內(nèi)皮時,不要過深和刮至血管斷面處,以免引起成纖維細(xì)胞污染。
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