吖啶橙染色液的制備
吖啶橙(acridine orange,AO)是一種常用熒光染料,吖啶橙與原代細胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力,但有一定的特異性,即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光,DNA呈亮綠色,而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡便快捷,既可染活原代細胞又可染固定原代細胞。用于直凄染色觀察活原代細胞或固定染色觀察原代細胞均可。吖啶橙對活原代細胞毒性小,可用于直接染色活原代細胞和進行熒光顯微鏡觀察,但不持久,用固定染色觀察法效果更好。
(一)吖啶橙染色液的制備
取1g吖啶橙,溶于100ml生理鹽水中,配成1%的母液,4℃保存?zhèn)溆?。使用時,用0.1mol/L PBS(pH4.8)稀釋成O.01%的工作液。
(二)染色步驟以蓋玻片培養(yǎng)法為例
1.標(biāo)本用Hanks脫洗3次。
2.用95%乙醇溶液固定15~30min,取出后晾干。
3.用l%醋酸作用30s。
4.用PBS沖洗1min。
5.移入0.1mol/L吖啶橙顯色液中染色1~5min,分色30s~2min。
6.用PBS沖洗lmin。細胞
7.移入O.1mol/L CaCl2中分色30s~2min。
8.用PBS沖洗1min。
9.用甘油一PBS(1:1)封片,立即觀察(用激發(fā)波長405nm的濾光片)。
(三)結(jié)果
細胞核內(nèi)因含DNA而呈亮綠色,胞質(zhì)及核仁因含RNA而呈橘紅色或火紅色。
(四)注意事項
觀察中應(yīng)隨時添加PBS以避免標(biāo)本干涸,如用油浸鏡觀察,需再覆蓋以大蓋玻片蓋在附有細胞蓋玻片上(細胞面朝上),用無熒光性油浸觀察。標(biāo)本在95%乙醇中能保存數(shù)日后仍能觀察,如褪色,再用吖啶橙染色。
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