細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)
細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)是測定單個細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是單個細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上時細(xì)胞數(shù)量已達(dá)60個左右,此細(xì)胞群體成為克隆或集落,大小在0.3~1.0mm之間。通過計數(shù)克隆形成率,可對單個細(xì)胞的增殖潛力做定量分析,了解細(xì)胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應(yīng)性??寺⌒纬陕矢哒咂洫?dú)立生存能力強(qiáng),例如永生性細(xì)胞或癌細(xì)胞克隆形成率高,正常細(xì)胞則很低。常用的方法有平板克隆形成試驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。
一、材料
1.待測的培養(yǎng)細(xì)胞。
2.細(xì)胞培養(yǎng)液.0.25%,PBS溶液,Giemsa染色液。
3.培養(yǎng)皿.吸管,培養(yǎng)板。
4.CO2培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡。
二、方法
1.制備細(xì)胞懸液低密度細(xì)胞懸液一般根據(jù)需要配成]0~100個/ml。取生長良好的對數(shù)生單層培養(yǎng)細(xì)胞,吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液,用0.25%消化并吹打成單個細(xì)胞,把細(xì)胞懸浮在含10%牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。
2.接種和培養(yǎng)用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液,使之混懸均勻后,將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋,以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(根據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,并輕輕轉(zhuǎn)動,使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下,靜置培養(yǎng)2~3周。
3.觀察當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時,終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS小心洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml,固定15min。然后棄掉固定液,加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10~30min,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。
三、結(jié)果分析
1.計算各皿克隆數(shù)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計數(shù)克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。
2.計算克隆形成率計算公式為:
克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%
四、注意事項(xiàng)
1.克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系,為減少實(shí)驗(yàn)誤差,細(xì)胞懸液中細(xì)胞應(yīng)分散充分,單個細(xì)胞比率至少在90%以上。此外,接種密度不能過大。
2.培養(yǎng)期問應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適當(dāng)更換培養(yǎng)液。
3.平板克隆形成試驗(yàn)方法簡單,適用于貼壁生長的細(xì)胞。
4.由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同,細(xì)胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱,傳代細(xì)胞系強(qiáng);二倍體細(xì)胞克隆形成率弱,轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng);正常細(xì)胞克隆形成率弱.腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。
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