鴨極低密度脂蛋白(VLDL)酶聯(lián)免疫elisa分析試劑盒的間接法
鴨極低密度脂蛋白(VLDL)酶聯(lián)免疫elisa分析試劑盒檢測未知抗體的間接法:
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜。
2.次日洗滌3次。
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,一遍用DDW洗滌。
4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。
5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號(hào)表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽性。
競爭法的簡要操作步驟:
1)先加入特異性抗原,使抗原固定結(jié)合于載體表面;
2)加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標(biāo)抗體混合物,并做只加酶標(biāo)抗體的對(duì)照組;
3)加入酶促反應(yīng)底物,發(fā)生顯色反應(yīng),對(duì)比實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色差異,計(jì)算未知抗體的量。