胱抑素CElisa試劑盒顯色和比色分析
顯色是胱抑素CElisa試劑盒中的后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色適當縮短或延長反應時間,及時判斷。
OPD(鄰苯二胺)底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長反應時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應應避光進行,顯色反應結(jié)束時加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB(四甲基聯(lián)苯胺)受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
胱抑素CElisa試劑盒比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標準96孔的座架中,才可進行比色。好在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。
比色時應先以蒸餾水校零點,測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進行計算。
胱抑素CElisa試劑盒測讀A值時,要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀,即每孔先后測讀兩次,次在適波長(W1),第二次在不敏感波長(W2),兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1,630nm為W2,終測得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
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