17羥孕酮Elisa試劑盒氧化耦聯(lián)色原底物對
17羥孕酮Elisa試劑盒HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對主要有4—氨基:耦聯(lián)底物對(Trinder試劑)和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙(MBTH);二甲基苯胺(DMA)耦聯(lián)底物對(Ngo—Lenhoff試劑)等。
在H202存在下,4—氨基和經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺,其在入=492 nm處有zui大吸收。
該耦聯(lián)色原底物對用于固相ELISA時(shí),敏感性一般較低,反應(yīng)見光不穩(wěn)定,而且易發(fā)生多聚化,缺乏適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)終止劑。因此,該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標(biāo)的酶法檢測應(yīng)用。1989年日本學(xué)者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標(biāo)記酶的均相酶免疫試驗(yàn),可用甲醛終止反應(yīng)。但這種方法僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段,其后也未見有其他實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用報(bào)道,可能還有其固有的缺陷。
4—氨基:耦聯(lián)底物對色原底物的具體配方為①顯色底物溶液:將4—氨基以2 mmol/L,以25 mmol/L和H202以0.8 mmol/L的濃度溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2),即可應(yīng)用;②終止液:未見報(bào)道;③測定波長:492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍(lán)色的吲達(dá)胺(indamine),zui大吸收波長為590nm,見光不穩(wěn)定。用鹽酸或硫酸終止反應(yīng)后,pH應(yīng)為3.0左右,pH值的降低使顯色從紫藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{(lán)色,zui大吸收波長從590nm變?yōu)?95nm,然而pH值的進(jìn)一步降低,將導(dǎo)致光吸收消失。
MBTH:DMA耦聯(lián)對在固相ELISA測定幾乎沒有應(yīng)用。
堿性磷酸酶(AP)
在17羥孕酮Elisa試劑盒測定中,堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對硝基苯磷酸鹽。在堿性磷酸酶的作用下生成對硝基酚(),其在入=405 nm處有zui大吸收.
由于堿性條件下的光吸收增強(qiáng),并可使堿性磷酸酶失活,因而可使用碳酸鈉作為終止劑。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺,因?yàn)閱我掖及穼A性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用。較高濃度的無機(jī)磷可競爭性地抑制堿性磷酸酶的活性,貯存時(shí)間過長由于非酶水解而產(chǎn)生硝基酚和磷酸鹽時(shí)即可出現(xiàn)這種情況,此時(shí)呈黃色。
因此,用于ELISA測定時(shí),必須五色。的摩爾消光系數(shù)(光吸收)的變化取決于溶液的pH及溫度、離子強(qiáng)度、蛋白含量,當(dāng)溫度從15~C升高至45℃時(shí),在入=405 nm處的光吸收將增加5%~7%。
在17羥孕酮Elisa試劑盒測定時(shí),色原底物的具體配方為①顯色底物溶液:將以10 mmol/L的濃度溶于含1 mmol/LMgCl:的0.1 mol/L二乙醇胺緩沖液(pH 9.8),即可應(yīng)用;②終止液:0.5 mol/L碳酸鈉;③測定波長:405nm。