ELISA 的類型
ELISA 的類型
ELISA 可用于測定抗原,也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑:(1)固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑 "(immunosorbent);(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"(conjugate);
(3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA 主要有以下幾種類型:
2.2.1 雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2)加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3) 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,測知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗(yàn)中,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測。
在一步法測定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成 "夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg 、AFP 和尿液hCG 等)時(shí),應(yīng)注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。