蛋白的Wnt基因-6(WNT6)ELISA試劑盒原理
此法采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)??贵w具體為WNT6已經(jīng)被預先涂到微孔板。標準和樣品吸入井和任何WNT6目前被綁定的固定化抗體。共軛的抗體特異性WNT6除去任何未結(jié)合的物質(zhì)后,加入到孔中??沟鞍坠曹椀睦备^氧化物酶(HRP)的洗滌后,加入到孔中。經(jīng)過洗滌,以除去任何未結(jié)合的抗蛋白的酶試劑,底物溶液加入到孔中,顯色成比例的量的初始步驟中的約束的WNT6。彩色顯影被停止并測量的顏色的強度。ELISA試劑盒
血清:使用血清分離管(SST)和全血標本在室溫下兩小時或4℃過夜℃,然后離心15分鐘,在1000×g下。刪除上清即可檢測,或分裝和店內(nèi)樣品在-20°C或-80°C。但應避免反復凍融循環(huán)。
此法具有較高的靈敏度和特異性好,檢測鼠標WNT6。觀察鼠標WNT6和類似物之間無顯著交叉反應或干擾。
精度:
批內(nèi)精密度(內(nèi)檢測精度):CV%<8%
三種已知濃度的樣品進行了測試20次在一個平板上進行評估。
間精密度(精密檢測間):CV%<10%
已知的三個樣本20檢測到的濃度進行了測試評估。
樣品采集和存儲:
等離子:采集血漿中EDTA或肝素作為抗凝血劑。在2-8°C在30分鐘內(nèi)收集離心15分鐘,1000×G。即可檢測,或分裝保存樣本在-20°C或-80°C。但應避免反復凍融循環(huán)。
檢測程序:
在使用前,將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍后測定前。據(jù)建議,所有樣品和標準來測定一式兩份。
1。準備好所有試劑,工作標準和樣品在前面的章節(jié)中。
2。請確定井數(shù)的使用,并把任何剩余的井和入袋干燥劑,密封保鮮袋,將未使用的井在4°C的含量布局表
。每孔加入100μl的標準和樣品。封面用膠粘帶提供。孵育2小時,在37℃下一盤布局記錄標準和樣品檢測。
4。每孔中取出的液體,不洗。
5。向每孔中加入100μl抗體(1倍)。蓋上一個新的膠粘帶。孵育1小時,在37℃下(抗體(1X)可能會出現(xiàn)混濁。預熱至室溫,輕輕混勻,直到出現(xiàn)均勻解決方案。)
6。吸液的各孔和洗滌,共洗滌三次重復該過程兩次。洗凈,每孔填充洗滌緩沖液(200μL)使用噴瓶,多道移液器,歧管器,或autowasher,和,靜置2分鐘,*清除液體的每一步是*的良好的性能。zui后一次洗滌后,清除任何剩余洗滌緩沖液的吸ordecanting。倒置板和涂抹對干凈的紙巾。
7。向每孔中加入100μl的HRP-抗蛋白(1×)。量的微量滴定板,用一個新的粘接劑條。溫育1小時,在37℃下
8。重復的愿望/洗滌過??程中,在步驟6的5倍。
9。將90μlTMB底物添加到每個孔中。孵育15-30分鐘,在37℃下避光
10。一站式解決方案,每孔加入底物,輕輕晃動酶標板,以確保充分混合。
11。在5分鐘內(nèi),設置至450nm,使用酶標儀測定各孔的光密度。如果波長校正,設置為540nm或570nm處。在540nm或570nm波長在450nm處的讀數(shù)減去讀數(shù)。該減法校正板的光學缺陷。在450nm處未經(jīng)修正讀數(shù)直接,可能會比較高,不太準確。
計算結(jié)果:
建議使用專業(yè)的軟“曲線專家1.3”的標準曲線。
平均每個標準和樣品的重復讀數(shù)和平均減去零標準的光學密度。
標準曲線,通過減少使用能產(chǎn)生四參數(shù)邏輯(4-PL)的曲線擬合的計算機軟件的數(shù)據(jù)。作為一種替代方法,建立標準曲線,對在y-軸的濃度通過繪制在x-軸為每個標準的平均吸光度,并繪制一個通過在曲線圖上的點的zui擬合曲線。該數(shù)據(jù)可以通過繪制的WNT6濃度與日志的OD值和擬合直線的日志,可以通過回歸分析確定線性化。此過程會產(chǎn)生足夠的,但不太的適合的數(shù)據(jù)。
如果已稀釋的樣品,從標準曲線上讀出的濃度必須乘以稀釋因子。ELISA試劑盒