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制備感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn)化

點(diǎn)擊次數(shù):1196 更新時(shí)間:2016-02-19

制備感受態(tài)細(xì)胞:

1、從37℃培養(yǎng)16-20h的平板中挑取一個(gè)單菌落(直徑2-3mm),轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3h。一般經(jīng)驗(yàn),1OD600約含有大腸桿菌DH1×109個(gè)/ml。

    為達(dá)到轉(zhuǎn)化,活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108 細(xì)胞/ml,對(duì)于大多數(shù)大腸桿菌來(lái)說(shuō),這相當(dāng)于OD600值為0.4左右。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)密度不致過(guò)高,可每隔15-20min測(cè)定OD600 來(lái)監(jiān)測(cè),用監(jiān)測(cè)的時(shí)間及OD600 列一個(gè)圖表,以便預(yù)測(cè)培養(yǎng)物OD600值達(dá)到0.4的時(shí)間,當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時(shí),收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。

    在菌株和菌株之間,OD600值與每毫升活細(xì)胞數(shù)見(jiàn)的關(guān)系變化很大,因此有必要通過(guò)測(cè)定特異大腸桿菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)物在生長(zhǎng)周期的不同時(shí)相的OD600值,并將各稀釋濃度的培養(yǎng)物鋪于物抗生素的LB瓊脂板以計(jì)算每一時(shí)相的活細(xì)胞數(shù),從而使分光光度計(jì)讀數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化。

2、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中,在冰上放置10min,使培養(yǎng)物冷卻至.0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3 轉(zhuǎn)頭以4100r/min離心10min,以回收細(xì)胞。

4、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡。

5、每50ml初始培養(yǎng)液用30ml預(yù)冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3 轉(zhuǎn)頭以4100r/min離心10min,以回收細(xì)胞。

7、倒出培養(yǎng)液,將管導(dǎo)致1min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡。

8、每50mo初始培養(yǎng)物用2ml用并預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細(xì)胞沉淀。

9、此時(shí),可以按步驟10-16用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),也可以將細(xì)胞凍存于-70℃。

轉(zhuǎn)化:

包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照

10、用冷卻的無(wú)菌吸頭從每份用CaCl2溶液制備的感受態(tài)懸液中西區(qū)200ul轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管(17*100mm)中,每管加入DNA(用不超過(guò)10ul的體積,其中的DNA小于50ng),輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30min。

11、將管放入預(yù)加熱至42℃的循環(huán)水浴中,恰恰放置90s,不要搖動(dòng)管。

熱激是一個(gè)關(guān)鍵步驟,準(zhǔn)確地達(dá)到熱敷溫度非常重要。

12、快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1-2min。

13、每管加800ulSOC培養(yǎng)基,用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上,溫育45min,使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。

    復(fù)蘇期中應(yīng)于37℃溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞(用低于50r/min轉(zhuǎn)速的搖床)。

14、將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板達(dá)200ul)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB瓊脂培養(yǎng)基上。

    如果用四環(huán)素作為選擇標(biāo)記,全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個(gè)單獨(dú)的平米上(或軟瓊脂中),可以現(xiàn)在微量離心機(jī)哈桑室溫離心20s以收集轉(zhuǎn)化菌,加100ulSOC重懸沉淀,輕輕混勻。

    重要:玻璃鋪菌器需先在乙醇在浸泡,然后在酒精燈上灼燒,待它涼至室溫后,才可將轉(zhuǎn)化菌輕輕地鋪在瓊脂板上。

    如檢查氨芐的抗性,用轉(zhuǎn)化菌鋪平板時(shí)密度應(yīng)較低(每個(gè)90mm平板不超過(guò)104菌落),于37℃培養(yǎng)的時(shí)間按不超過(guò)20h。氨芐抗性的轉(zhuǎn)化體可將β-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中,迅速滅活菌落周?chē)鷧^(qū)域的。這樣,鋪平板時(shí)密度過(guò)高或培養(yǎng)時(shí)間按過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致出血對(duì)氨芐敏感的衛(wèi)星菌落。在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐而用羧芐,以及將抗生素濃度從60ug/ml提高到100mg/ml,可使情況有所改善,但不能產(chǎn)地*之??拱逼S的增加與平皿上所加的細(xì)菌數(shù)的增加并無(wú)線(xiàn)形比例關(guān)系,這可能是因?yàn)楸豢股貧⑺赖?a >細(xì)胞釋放生長(zhǎng)抑制物質(zhì)的緣故。

15、將平板置于室溫直至液體被吸收。

16、倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12-16h后可出現(xiàn)菌落。

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