微細(xì)毛圓線蟲(chóng)探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒技術(shù)的定量原理
微細(xì)毛圓線蟲(chóng)探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒技術(shù)的定量原理:
擴(kuò)增曲線
在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。
在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。
PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期"。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。
產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來(lái)也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。
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